高靈敏度脂滴長時間成像熒光染料

LipiDye II 是一款可用于長時間活細胞成像的高靈敏度優(yōu)質(zhì)脂滴染料試劑。此外，它還具有脂滴特異性高、毒性低和光穩(wěn)定性高的優(yōu)點。適用于以天數(shù)為單位的長時間觀察、脂滴融合和分解過程的活細胞成像以及使用超高分辨率顯微鏡的超微小脂滴可視化。

※ 本產(chǎn)品基于名古屋大學(xué) 變革生命分子研究所 山口茂弘教授、多喜正泰特任準(zhǔn)教授的研究結(jié)果，由funakoshi株式會社進行商品化并銷售。

※ 本產(chǎn)品僅供研究用，請勿用于研究以外用途。

使用LipiDye II染色脂肪細胞和非脂肪細胞的案例

◆關(guān)于脂滴（Lipid droplet）和LipiDye

脂滴（Lipid droplet）是在脂肪細胞（Adipocyte）中發(fā)現(xiàn)的大型中性脂肪的結(jié)塊，主要成分是甘油三酯（Triglyceride）和甾醇酯（Sterol Ester）的單分子層結(jié)構(gòu)體（圖1）。脂滴被認為是儲存細胞內(nèi)中性脂質(zhì)的細胞器，并且有較多肥胖和疾病相關(guān)的報道。最近，除了脂肪細胞，還在肝細胞、平滑肌細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等各種細胞中發(fā)現(xiàn)了脂滴。這些發(fā)現(xiàn)明確了其不僅僅是作為中性脂質(zhì)的儲存場所，還有抑制代謝和調(diào)節(jié)基因表達等各種功能。對各種細胞中的脂滴進行觀察發(fā)現(xiàn)，非脂肪細胞的脂滴在1 μm以下，與脂肪細胞中的10~100 μm的脂滴相比較小（圖2）。因此，可以利用成像來檢測活細胞中非脂肪細胞的微小脂滴的試劑備受期待，但目前Nile Red等現(xiàn)有試劑會觀察到脂滴以外的染色試劑（信噪比低），不適用于活細胞成像，觀察微小脂滴僅限于電子顯微鏡觀察。

而LipiDye 是一款可以顯示高S/N比率的脂滴染色試劑，雖然檢測1 μm以下的小脂滴的效果優(yōu)異，但從光穩(wěn)定性的觀點來看，長時間活細胞成像的效果不佳。而LipiDye II 是名古屋大學(xué) 變革生命分子研究所（ITbM）的山口教授、多喜特任準(zhǔn)教授為了解決上述問題而研發(fā)的新型脂滴檢測試劑（參考文獻中的名稱為LAQ1），光穩(wěn)定性非常高，毒性低，適合用于長時間穩(wěn)定的活細胞成像。

圖1：脂滴的模式圖及脂肪細胞（adipocyte）中可見的大型脂滴

圖2：不同細胞類型中脂滴的成像圖例

◆特點

●　不僅可以選擇性濃縮脂滴，還會響應(yīng)疏水性環(huán)境而發(fā)出熒光，因此可以抑制細胞質(zhì)等的部分發(fā)光，對脂滴有著高信噪比（S/N比）

●　可檢測非脂肪細胞中的小型脂滴（小于1 μm）

●　光穩(wěn)定性高，長時間活細胞成像效果優(yōu)異

●　由于不會褪色，可用于脂滴分解過程中的熒光觀察

●　在推薦的使用濃度（0.1~1 μM）中幾乎不顯示細胞毒性。在已添加試劑的狀態(tài)下，脂肪細胞分化過程的觀察記錄最長達8天

●　活細胞、固定細胞都可使用。也適用于活細胞染色后再固定處理的情況

●　也適用于STED超高分辨率顯微鏡。可觀察到約200 nm（半峰全寬）的脂滴

◆關(guān)于熒光波長（激發(fā)/發(fā)射波長）

激發(fā)/發(fā)射波長：400~500 nm/490~600 nm

※ 雖然最大吸收為410~420 nm，但也可用450~500 nm范圍的光源激發(fā)。詳情請參考下方的激發(fā)/發(fā)射光譜數(shù)據(jù)。

※ 可用800 nm激光進行雙光子激發(fā)。詳情請參考下方利用雙光子顯微鏡觀察小膠質(zhì)細胞。

※ 可進行多重染色，但需要注意波長的選擇。請使用激發(fā)光在500 nm以上的染料。若使用在450 nm以下的范圍內(nèi)激發(fā)的普通藍色熒光染料，可能

※ 會同時激發(fā)本試劑。

■　光源示例

◆LipiDye與其他試劑相比的優(yōu)點

◆參考文獻

"Fused Thiophene-S,S-dioxide-Based Super-Photostable Fluorescent Marker for Lipid Droplets."

Taki, M., et al., ACS Mater. Lett., 3(1), 42～49 (2021)

◆參考數(shù)據(jù)

激發(fā)/發(fā)射光譜

LipiDye II是溶劑環(huán)境響應(yīng)型熒光染料（Solvatochromic dye），會根據(jù)周圍的分子極性改變熒光波長。吸收光譜幾乎不受溶劑的影響，可觀察到在380~500 nm的吸收（圖A）。

● 推薦激發(fā)光：405 nm、445 nm、458 nm、473 nm激光

● 可使用的激發(fā)光：488 nm激光（由于熒光強度弱，建議根據(jù)不同的實驗對使用濃度等進行驗證。）

另外，熒光光譜依賴于溶劑極性，在甲苯和二氯甲烷等疏水性環(huán)境下會顯示強烈的藍~綠色熒光，但在乙腈、DMSO和水溶液等高極性環(huán)境下，極性越大，最大熒光就會轉(zhuǎn)移至長波長一側(cè)，對熒光強度的抑制就越明顯（圖B）。根據(jù)這個特性，可觀察到脂滴在疏水性環(huán)境下的特異性綠色熒光。

用LipiDye II對細胞染色，用顯微鏡光譜掃描脂滴部分，評估脂滴的熒光，約在500 nm附近可觀察到最大的熒光光譜（圖C）。

※ 圖A~圖C的灰色陰影區(qū)域為推薦激發(fā)/熒光波長。

光穩(wěn)定性

用4%多聚甲醛固定處理3T3-L1脂肪細胞，再分別用新產(chǎn)品LipiDye II、舊款產(chǎn)品LipiDye 和傳統(tǒng)的熒光染料B染色，之后使用共聚焦激光顯微鏡反復(fù)進行Z-stack成像（激發(fā)473 nm/熒光：490~540 nm），觀察熒光強度的變化。在Z-stack成像中，每拍攝一次可獲取10張2 μm的圖像。傳統(tǒng)染料B經(jīng)過約5次的Z-stack成像后衰減明顯，而相比之下，舊款產(chǎn)品LipiDye雖然有耐光性，但也觀察到了緩慢的衰減，在經(jīng)過50次的Z-stack成像后熒光衰減至60％左右。

而在本試劑LipiDye II中，即使經(jīng)過50次（共計500次的光照射），其熒光強度也幾乎不發(fā)生變化。顯示了LipiDye II具有非常高的光穩(wěn)定性，適用于長時間的延時成像（包括Z-stack成像）。

細胞毒性

使用不同濃度的LipiDye II 處理 3T3-L1脂肪細胞，然后使用MTT Assay評估24 h后的細胞活性。本試劑的推薦使用濃度為0.1~1 μM，但至少在5 μM內(nèi)未觀察到細胞毒性。在10 μM以上才觀察到細胞毒性。

活細胞和固定細胞染色

用LipiDye II對活細胞狀態(tài)下的3T3-L1脂肪細胞染色，然后在活細胞中進行熒光觀察（左圖）。之后，用4%多聚甲醛固定細胞，清洗后在固定狀態(tài)下再次進行熒光觀察（右圖）。固定前后幾乎未觀察到熒光信號的變化。表明了本試劑除了可用于活細胞染色，也可兼容固定細胞的免疫染色。

LipiDye^®染色的活細胞和經(jīng)PFA固定后的熒光強度的對比

◆應(yīng)用數(shù)據(jù)

在各種細胞中的染色

用LipiDye II（1 μm）分別染色3T3-L1、HepG2、COS-7、HeLa細胞，在共聚焦激光顯微鏡下觀察綠色熒光（激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm）（比例尺：20 μm）。在HepG2中，為使脂滴形成，用脂肪酸處理了1天。在HeLa細胞中可清晰地觀察到1 μm以下的小脂滴（參考Hela細胞放大圖像（右側(cè)），比例尺：5 μm）。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）標(biāo)記及其多色成像

用LipiDye II（1 μm）對表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）駐留紅色熒光蛋白（ER-mKO1）的COS-7細胞進行染色，使用共聚焦激光顯微鏡進行熒光觀察（LipiDye II：激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm，ER-mKO1：激發(fā)559 nm/熒光570~620 nm）。可以觀察到COS-7細胞內(nèi)部的小脂滴（＜1 μm），并且大部分駐留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)（參考右側(cè)的放大圖，比例尺：1 μm）。該結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在脂滴的生物合成。

長時間觀察脂肪細胞的分化過程

用LipiDye II在共聚焦激光顯微鏡下觀察活細胞中誘導(dǎo)前脂肪細胞3T3-L1分化為脂肪細胞時，成熟脂滴的狀態(tài)8天（激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm）。前2天在含LipiDye II的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3T3-L1細胞，之后每隔兩天更換至含LipiDye II（1 μm）的維持培養(yǎng)基中，熒光觀察共計8天。即使用LipiDye II進行長時間的處理，也沒有細胞毒性和對脂肪細胞分化產(chǎn)生影響，可以觀察到脂滴成熟的過程。

活細胞成像中新生脂滴的動態(tài)行為分析

利用長時間延時成像（Z-stack成像），觀察在誘導(dǎo)前脂肪細胞3T3-L1分化為脂肪細胞時新生脂滴的動態(tài)行為約24 h（共聚焦激光顯微鏡：激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm，每10 min拍攝一次，Z-stack 20張/次）。向預(yù)先已經(jīng)用LipiDye II染色的前脂肪細胞中添加分化培養(yǎng)基（含有LipiDye II），然后立即開始延時成像。分化誘導(dǎo)后約10 h，開始看到小脂滴的出現(xiàn)（650 min，白色箭頭），可以觀察到各脂滴在相互作用的同時，不斷成長的狀態(tài)（950~1450 min，黃色箭頭）。

觀察脂滴分解·新生過程隨著時間的變化

向分化誘導(dǎo)的3T3-L1細胞中添加腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin（10 μM）和磷酸二酯酶抑制劑IBMX（100 nM），觀察在使用了LipiDye II的延時成像（Z-stack）中脂滴隨著三酰基甘油的分解而縮小的過程（共聚焦激光顯微鏡：激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm，800 min，每4 min拍攝一次，Z-stack 15張/次）。從圖中可以看到原本的大脂滴（請參見白色箭頭）隨著時間的推移逐漸變小。另外，可以看到隨著時間的推移又產(chǎn)生了許多小脂滴（黃色三角形）。

結(jié)果表明，LipiDye II具有非常高的光穩(wěn)定性，無需擔(dān)心褪色；并有著高信噪比，可以觀察到微小的新生脂滴，因此可以定量觀察脂滴的增減。

利用STED超高分辨率顯微鏡可視化微小脂滴

用LipiDye II（1 μm）染色Hela細胞，使用激光共聚焦顯微鏡（Confocal）（激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm）和STED超高分辨率顯微鏡（激發(fā)473 nm + STED 660 nm/熒光500~640 nm）對微小脂滴進行觀察。STED觀察圖像顯示的是經(jīng)過反卷積處理的數(shù)據(jù)。從圖中可以發(fā)現(xiàn)在共聚焦激光顯微鏡下較為模糊的微小脂滴，在STED顯微鏡中非常清晰，半峰全寬（FWHM）約為120 nm。

※    關(guān)于STED顯微鏡的觀察條件及分析方法，請見參考文獻。

利用雙光子顯微鏡觀察小膠質(zhì)細胞

向大鼠原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞中添加LipiDye II（1 μm），染色過夜后，用4%PFA固定，然后在雙光子顯微鏡下進行觀察。可見LipiDye II使用雙光子激發(fā)法也可以激發(fā)，可以檢測原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞中尺寸各異的脂滴。

（數(shù)據(jù)提供：Dr. Hyun Beom Choi以及 Dr. Brian MacVicar, The University of British Columbia）

※ 本頁面產(chǎn)品僅供研究用，研究以外不可使用。